Beleuchten von Zellen in 3D

Eine Revolution in der Lichtmikroskopie ermöglicht es Wissenschaftlern, Strukturen zu vergrößern, die noch nie zuvor mit sichtbarem Licht sichtbar gemacht wurden. Neue hochauflösende Mikroskopietechniken, die in mehreren Labors entwickelt werden, ermöglichen es Wissenschaftlern, Strukturen zu betrachten, die aufgrund der inhärenten Auflösungsgrenze, die durch die Wellenlänge des Lichts auferlegt wird, einst zu klein waren, um sie unter einem Lichtmikroskop zu sehen.

Mit einer Technik namens PALM können Harald Hess und Kollegen die Positionen vieler verschiedener Membranproteine ​​in zwei Dimensionen lokalisieren.

Wissenschaftler des Janelia Farm Research Campus des Howard Hughes Medical Institute haben kürzlich die Entwicklung einer Technik namens interferometrische photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (iPALM) angekündigt, die es ihnen ermöglicht, dreidimensionale Bilder von Strukturen innerhalb von Zellen in der höchsten Auflösung zu erstellen, die bisher mit einem optischen Mikroskop gesehen wurde.

Die Technik, deren Details kürzlich veröffentlicht wurden in Proceedings of the National Academy of Sciences , fügt einem früheren Ansatz namens PALM eine dritte Dimension hinzu, der fluoreszierende Moleküle verwendet, die ein- und ausgeschaltet werden können, um die Details kleiner Strukturen unter einem Lichtmikroskop aufzulösen. Bei PALM wird zu jedem Zeitpunkt nur ein kleiner Teil der fluoreszierenden Moleküle innerhalb einer Zelle eingeschaltet, wodurch ein Lichtschleier in einen relativ spärlichen Satz heller Flecken umgewandelt wird, die einzeln aufgelöst werden können und die Position von mit Fluoreszenz markierten Proteinen verraten Moleküle. Durch das Zusammenfügen vieler Bilder erstellen die Forscher ein vollständiges zweidimensionales Bild.

Um PALM eine dritte Dimension hinzuzufügen, wandten sich die Forscher der Interferometrie zu, einer Technik, die weit verbreitet zum Messen von Winkeln und Abständen im mikroskopischen Maßstab verwendet wird. Licht von fluoreszierenden Molekülen in der Probe wird von oben und unten eingefangen und die beiden Lichtstrahlen werden zu einem Strahlteiler geschickt, der sie auf drei verschiedene Kameras lenkt. Die Lichtmenge, die jede Kamera erreicht, kann verwendet werden, um die vertikale Position jedes fluoreszierenden Moleküls innerhalb der Probe zu berechnen. Am Ende sind wir in der Lage, die Position in allen drei Richtungen eines Moleküls in weniger als 20 Nanometern oder etwa der 10-fachen Größe eines durchschnittlichen Proteins zu bestimmen, sagt Harald Hess , die Wissenschaftlerin von Janelia Farm, die die Studie leitete. Klicken Sie hier, um Bilder von Zellstrukturen anzuzeigen, die mit iPALM erstellt wurden.

John Sadat , Professor für Biochemie und Biophysik an der University of California, San Francisco, sagt, dass das Papier eine Meisterleistung bei der Verbesserung der Auflösung von Lichtmikroskopen ist. Er fügt jedoch hinzu, dass einer der Kompromisse bei der Verwendung einer so hohen räumlichen Auflösung für die biologische Bildgebung darin besteht, dass derzeit Zellen abgetötet und chemisch fixiert werden müssen, damit Ereignisse nicht in Echtzeit erfasst werden können. Die Herausforderung für das Feld besteht laut Sedat darin, Fortschritte in der räumlichen Auflösung mit der Echtzeit-Bildgebung lebender Zellen zu kombinieren.

Gleb Shtengel, einer der führenden Köpfe der neuen Technik, sagt, dass, obwohl die Zeit, die zum Kombinieren mehrerer Bilder erforderlich ist, es schwierig macht, schnelllebige Ereignisse mit iPALM zu erfassen, wir planen, es auf Live-Zellenbilder von sich langsamer bewegenden Ereignissen auszuweiten.

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